化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）發(fā)光原理
化學發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是將高靈敏度的化學發(fā)光檢測技術與高特異性的酶免疫分析技術相結合，用于檢測微量物質的免疫檢測技術。CLEIA反應基本原理是用參與催化某一發(fā)光反應的酶來標記抗體（或抗原），在抗原-抗體反應后加入化學發(fā)光底物，酶催化和分解底物發(fā)光，用光檢測儀檢測發(fā)光強度，最后通過標準曲線，根據光強換算出被測物的濃度。CLEIA常用方法包括：用于大分子抗原檢測的雙抗體夾心法、用于抗體檢測的雙抗原夾心法，和用于多肽類小分子抗原測定的競爭法。根據標記酶和酶促化學發(fā)光底物的不同CLEIA又可以分成不同的反應體系，其中辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）作為標記酶的CLEIA反應體系是最為常見的。
ALP標記的化學發(fā)光酶免疫分析
堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）是一種分子量為80kD或100kD的磷酸單酯水解酶，可從大腸桿菌或小牛腸黏膜提取獲得。ALP最適pH為9.6（腸黏膜）或8.0（菌源性），在堿性環(huán)境中能夠將底物去磷酸化。堿性磷酸酶的酶促化學發(fā)光底物有AMPPD（1，2－二氧環(huán)乙烷衍生物，螺旋金剛烷）、CDP Star、APS-5等，其中AMPPD是最常見的ALP酶促化學發(fā)光底物。
1）ALP-AMPPD發(fā)光體系
AMPPD中文全稱為3-（2-螺旋金剛烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1，2-二氧環(huán)乙烷，是一種生物化學領域中超靈敏的堿性磷酸酶底物，具有底物穩(wěn)定性好、反應速度快的特點。AMPPD分子結構中有兩個重要部分，一個是連接苯環(huán)和金剛烷的二氧四節(jié)環(huán)，它可以斷裂并發(fā)射光子；另一個是磷酸根基團，它維持著整個分子結構的穩(wěn)定。堿性條件下AMPPD在ALP的作用下脫去磷酸根基團，形成一個不穩(wěn)定的中間體AMPD。AMPD分子內電子轉移后裂解成金剛烷酮和處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，釋放出光子回到基態(tài)，產生470nm的光，持續(xù)時間可達幾十分鐘至數小時。
2）ALP-CDP Star發(fā)光體系
CDP-Star中文名為2-氯-5-（4-甲氧基螺[1，2-二氧雜環(huán)丁烷-3，2′-（5-氯三環(huán)[3.3.1.13.7]癸烷]）-4-基] -1-苯基磷酸二鈉，是由AMPPD改進而來，對ALP標記分子的檢測更靈敏，反應動力學更好。CDP-Star具有低背景、酶催化強度高、光輸出時間長的特點。
3）ALP-APS-5發(fā)光體系
APS-5中文名為9-（4'-氯苯硫代磷酰氧亞甲基）-10-甲基-9，10-二氫化吖啶二鈉鹽，是一種基于9，10-二氫吖啶的發(fā)光底物，在ALP作用下可以持續(xù)發(fā)光。APS-5對ALP標記分子的檢測靈敏，但未在ALP標記的化學發(fā)光酶免疫分析上廣泛應用。
HRP標記的化學發(fā)光酶免疫分析
辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）來源于蔬菜植物辣根中，分子量為40kD，由無色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結合而成。輔基是酶活性基團，最大吸收峰在403nm處；而主酶與酶活性無關，最大吸收峰在275nm。HRP常用的化學發(fā)光底物為魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）、異魯米諾（4-氨基苯二甲酰肼）及其衍生物。用于辣根過氧化物酶（HRP）的化學發(fā)光底物多為雙組分系統，穩(wěn)定的H2O2和魯米諾（5－氨基－鄰苯二甲酰肼）是經典的HRP標記CLEIA反應體系。
1）HRP-H2O2-魯米諾發(fā)光體系
魯米諾（Luminol）又名發(fā)光氨，是一種化學熒光分子。堿性條件下，HRP催化魯米諾和過氧化氫的氧化反應，魯米諾與氫氧化物反應時生成了一個雙負離子（Dianion），它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產物為一個有機過氧化物。該過氧化物立即分解出氮氣（魯米諾被有機氧化劑如二甲基亞砜氧化后不是生成氮氣，而是生成含氮有機物），生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位于可見光的藍光部分，可在425nm下進行檢測。
2）HRP-H2O2-魯米諾-增強劑發(fā)光體系
傳統的HRP-H2O2-魯米諾CLEIA反應體系發(fā)光量低、不易測量，在發(fā)光體系中加入增強劑，魯米諾的發(fā)光靈敏度和發(fā)光信號提高，同時發(fā)光穩(wěn)定時間延長，降低氧化劑與發(fā)光劑等單獨作用時出現的“本底”發(fā)光。常用的增強劑有苯酚類、芳香胺類及苯基硼酸衍生物等，其中苯基硼酸類增強劑可以和苯酚類增強劑同時加入以提高分析靈敏度。
增強劑增強原理
當等量的H2O2與HRP混合后，有活性的酶底物復合物（Complex Ⅰ）迅速形成，但Complex Ⅰ與供氫體結合形成的復合物（Complex Ⅱ）形成速度較慢，而酚類及其芳香胺類等化合物都可作為HRP的第二底物（即供氫體），使得在反應中Complex Ⅰ及Complex Ⅱ的靜態(tài)濃度增大，顯著加快酶的循環(huán)速度。在增強劑的作用下，HRP-H2O2-魯米諾體系中的信號都被不同程度的增強，一定程度上解決了發(fā)光體系量子效率低、反應發(fā)光時效短等缺點，使HRP的靈敏度及精密度大大提高。
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