WS/T 677-2020人群維生素D缺乏篩查方法

中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布
2020-05-06 發(fā)布，2020-11-01實(shí)施

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所、寧波市疾病預(yù)防控制中心、深圳市慢性病防治中心、深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院、南京醫(yī)科大學(xué)、中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊麗琛、楊曉光、胡貽椿、金米聰、楊國(guó)武、周繼昌、汪之頊、賈健斌、王俊、陳曉紅、張協(xié)光、莫俊鑾、毛德倩、付志成、王睿、丁葉、周明、陳競(jìng)、張森。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了人群維生素D缺乏和不足篩查的指標(biāo)、參考判定值和檢測(cè)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于人群維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的判定。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 603 化學(xué)試劑 試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備
GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法
WS/T 225 臨床化學(xué)檢驗(yàn)血液標(biāo)本的收集與處理

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1 25-羥基維生素D 25-hydroxyvitamin D；25(OH)D

血液中維生素D的主要循環(huán)形式，穩(wěn)定性好，是公認(rèn)的評(píng)價(jià)人體維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況的可靠指標(biāo)，主要包括兩種形式：25(OH)D₂、25(OH)D₃，其中25(OH)D₃是血液中維生素D的主要存在形式。

3.2 維生素D缺乏 vitamin D deficiency

當(dāng)人體血清（或血漿）25-羥基維生素D含量低于缺乏的參考判定值時(shí)，可判定為維生素D缺乏。

3.3 維生素 D不足 vitamin D insufficiency

當(dāng)人體血清（或血漿）25-羥基維生素D含量低于正常人群的參考判定值，但高于缺乏參考判定值時(shí)，可判定為維生素D不足。

4 人群維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況判定指標(biāo)及參考判定值

人群維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況判定指標(biāo)及參考判定值見表1。

5 測(cè)定方法

5.1 血液標(biāo)本的采集與保存

按附錄A規(guī)定的方法進(jìn)行。

5.2 第一法：液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

按附錄B規(guī)定的方法進(jìn)行。

5.3 第二法：化學(xué)發(fā)光免疫法

按附錄C規(guī)定的方法進(jìn)行。

5.4 第三法：酶聯(lián)免疫法

按附錄D規(guī)定的方法進(jìn)行。

附錄A

血液標(biāo)本的采集與保存

A.1 標(biāo)本采集

A.1.1 血液標(biāo)本的采集

空腹靜脈血，取血方法依據(jù)WS/T 225 以及檢測(cè)方法的要求采集空腹靜脈血1mL。

A.1.2 采血管

根據(jù)所需血清或血漿，使用不同采血管分裝。

A.2 血清、血漿保

標(biāo)本于2℃～8℃可穩(wěn)定7d，-20℃可穩(wěn)定12個(gè)月。若標(biāo)本不能及時(shí)檢測(cè)，建議適量分裝后于-70℃以下存放標(biāo)本，僅一次凍融。

附錄B

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

B.1 原理

血清（血漿）中的25(OH)D2和25(OH)D3經(jīng)甲醇/乙腈沉淀蛋白，采用正己烷萃取，氮?dú)獯蹈桑贸跏剂鲃?dòng)相復(fù)溶，使用液相色譜法分離，串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）檢測(cè)，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，該方法可以分別測(cè)定25(OH)D₂和25(OH)D₃。

B.2 試劑和溶液

除非另有說明，本方法所有試劑均為分析純，水符合GB/T 6682中一級(jí)用水規(guī)定，溶液按照GB/T 603配制。

B.2.1 試劑

B.2.1.1 25(OH)D?₂標(biāo)準(zhǔn)品（C₂₈H₄₄O₂，CAS：21343-40-8）：純度＞98%或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

B.2.1.2 25(OH)D3標(biāo)準(zhǔn)品（C₂₇H_{44O2，CAS：19356-17-3）：純度＞98%或有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。}

B.2.1.3 同位素內(nèi)標(biāo)[²H₃]-25(OH)D₂標(biāo)準(zhǔn)品（C₂₈H₄₁²H₃O₂，CAS：1217467-39-4）：純度＞98%。

B.2.1.4 同位素內(nèi)標(biāo)[²H₃]-25(OH)D₃標(biāo)準(zhǔn)品（C₂₇H₄₁²H₃O₂，CAS：140710-94-7）：純度＞98%。

B.2.1.5 甲醇（CH₃OH）：色譜純。

B.2.1.6 正己烷（C₆H₁₄）：色譜純。

B.2.1.7 甲酸（HCOOH）：色譜純。

B.2.1.8 牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。

B.2.1.9 氮?dú)猓∟2）：純度≥99.9%。

B.2.1.10 甲酸-水溶液：0.1%。

B.2.1.11 甲酸-甲醇溶液：0.1%。

B.2.1.12 乙腈（CH₃CN）：色譜純。

B.2.1.13 BSA牛血清白蛋白水溶液：1%。

B.2.1.14 沉淀劑：甲醇+乙腈（1+1）。

B.2.1.15 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10μg/mL）：分別稱取25(OH)D₂和25(OH)D₃標(biāo)準(zhǔn)品1mg（精確至0.01mg）于2個(gè)100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液中25(OH)D₂和25(OH)D₃ 的濃度為10μg/mL。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，-20℃下避光保存，備用。

B.2.1.16 同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（10μg/mL）：分別稱取同位素內(nèi)標(biāo)[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃ 1mg（精確至0.01mg），于2個(gè)100mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。此溶液中[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的濃度為10μg/mL。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中，-20℃下避光保存，備用。

B.2.1.17 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別準(zhǔn)確移取25(OH)D₂（10μg/mL）和25(OH)D₃（10μg/mL）5μL、10μL、25μL、50μL、125μL、250μL和500μL于7個(gè)10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。此系列溶液的25(OH)D₂和25(OH)D₃的濃度為5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

B.2.1.18 混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液（100ng/mL）：分別準(zhǔn)確吸取同位素內(nèi)標(biāo)[²H₃]-25(OH)D₂儲(chǔ)備溶液（10μg/mL）和[²H₃]-25(OH)D₃儲(chǔ)備溶液（10μg/mL）各100μL，于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。此溶液的同位素內(nèi)標(biāo)[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的濃度均為100ng/mL。溶液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中后，-20℃下避光保存，備用。

B.2.2 儀器和設(shè)備

B.2.2.1 分析天平，感量：0.0001g。

B.2.2.2 分析天平，感量：0.00001g。

B.2.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。

B.2.2.4 氮吹儀或真空離心干燥儀。

B.2.2.5 離心機(jī)：離心力≥12000×g。

B.2.2.6 旋渦混合器。

B.2.2.7 移液槍或移液器。

B.3 分析步驟

B.3.1 樣品制備

取血清（血漿）樣品200μL至2mL離心管中，加入20μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩30s。加入400μL沉淀劑（甲醇+乙腈，1+1），室溫下渦旋振蕩混勻30s；加入1.2mL正己烷，室溫下渦旋振蕩5min，然后在4℃和離心力大于12000×g下離心5min；吸取1.0mL上清液至1.5mL離心管中，室溫下用氮?dú)獯抵粮桑挥?00μL初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋振蕩30s，4℃和離心力大于12000×g下離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中待LC-MS/MS分析。

B.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液制備

取7個(gè)2mL離心管，分別加入180μL空白替代血清樣品（1%BSA牛血清白蛋白水溶液），以及20μL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（B.2.1）和20μL混合同位素內(nèi)標(biāo)溶液，此系列相當(dāng)于0.5ng/mL～50ng/mL濃度范圍。旋渦振蕩30s。以下操作同B.3.1。

B.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀參數(shù)設(shè)置

B.3.3.1 液相色譜分析參考條件：

a) 色譜柱：C₁₈柱（柱長(zhǎng)100mm，柱內(nèi)徑2.1mm，填料粒徑1.7μm，或者具同等柱效的色譜柱)；
b) 流動(dòng)相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的甲醇溶液；
c) 梯度洗脫：見表B.1；
d) 流速：0.30mL/min；
e) 柱溫：40℃；
f) 進(jìn)樣體積：10μL。

B.3.3.2 質(zhì)譜測(cè)定參考條件：

a) 電離方式：電噴霧電離，正離子模式（ESI⁺ ）；
b) 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；
c) 氣簾氣：0.25MPa；
d) 噴霧電壓：4000V；
e) 去溶劑氣溫度：450℃；
f) 霧化氣：0.35MPa；
g) 去溶劑氣：0.35MPa；
h) MRM離子對(duì)參數(shù)見表B.2所示。

B.3.4 定性測(cè)定

在同一色/質(zhì)譜條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的測(cè)定，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中檢出的色譜峰的保留時(shí)間一致，所選擇的離子對(duì)的質(zhì)荷比也一致，而且樣品溶液中定性離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中的定性離子對(duì)的相對(duì)豐度比較，相對(duì)偏差也不超過表B.3規(guī)定的范圍，則可判定樣品溶液中存在該物質(zhì)。

B.3.5 工作曲線的制作

在B.3.3的液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析條件下，將B.3.2得到的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低濃度到高濃度進(jìn)行進(jìn)樣分析，以25(OH)D₂和25(OH)D₃色譜峰，與其對(duì)應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰的峰面積比值-濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的直線擬合方程，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。

B.3.6 樣品測(cè)定

在B.3.3的液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析參考條件下，將B.3.1得到的待測(cè)樣品溶液進(jìn)樣分析，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算待測(cè)試樣溶液中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度。待測(cè)試樣溶液中的目標(biāo)物的質(zhì)量濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)適當(dāng)稀釋樣品后再重復(fù)處理測(cè)定。

B.3.7 空白試驗(yàn)

以1%BSA牛血清白蛋白水溶液代替血清（血漿）樣品，按B.3.1的步驟做空白試驗(yàn)。

B.4 質(zhì)量控制

B.4.1 內(nèi)部質(zhì)控

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定測(cè)試結(jié)果質(zhì)量控制程序，明確內(nèi)部質(zhì)量控制的內(nèi)容、方式和要求。隨同樣品檢測(cè)需測(cè)定質(zhì)量控制樣品，繪制質(zhì)量控制圖，觀察測(cè)試工作的穩(wěn)定性、系統(tǒng)偏差及趨勢(shì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象并采取相應(yīng)的改進(jìn)措施。

B.4.2 外部質(zhì)控

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)參加國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可機(jī)構(gòu)組織的能力驗(yàn)證活動(dòng)，參加國(guó)際間、國(guó)內(nèi)同行間的實(shí)驗(yàn)室比對(duì)試驗(yàn)。根據(jù)外部評(píng)審、能力驗(yàn)證、考核、比對(duì)等結(jié)果評(píng)估檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量并采取相應(yīng)的改進(jìn)措施。

B.5 分析結(jié)果的計(jì)算

血清（血漿）樣品中25(OH)D2和25(OH)D3 的質(zhì)量濃度按式（B.1）計(jì)算：

C_target=c......................................(B.1)

式中：
C_target——血清（血漿）樣品中目標(biāo)物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
c——工作曲線中查出的樣品濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

注：結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留小數(shù)點(diǎn)后一位，血漿(血清)中25(OH)D總含量為25(OH)D₂和25(OH)D₃含量相加。

B.6 精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

B.7 檢出限和定量限

本方法25(OH)D₂、25(OH)D₃檢出限均為0.15ng/mL，定量限均為0.5ng/mL。

B.8 回收率

本方法的添加回收率為84.0%～106.0%。

B.9 25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3標(biāo)準(zhǔn)溶液LC-MS/MS色譜圖

25(OH)D₂和25(OH)D₃標(biāo)準(zhǔn)溶液的LC-MS/MS色譜圖見圖B.1，[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃標(biāo)準(zhǔn)溶液的LC-MS/MS色譜圖見圖B.2。

說明：圖B.1和圖B.2中峰1為[²H₃]-25(OH)D_3>；峰2為[²H₃]-25(OH)D₂。

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